グラフェン技術に関する最近の知見、脳神経コントロール

グラフェンを利用した最近の神経組織コントロールについて書かれていますが、
内容が専門的すぎるので興味ある人だけお読みください。

科学界では、工学、電子工学、バイオテクノロジー、生物医学などの幅広い分野で、グラフェンやグラフェンベースの材料の応用が急激に進んでいる。神経科学の分野では、これらの材料には2つの利点がある。一方では、グラフェンやグラフェン誘導体（酸化グラフェンやその還元体）でできたナノシートは、ドラッグデリバリー用のキャリアとして利用できる。ここで重要なのは、その毒性を評価することであり、毒性はフレークの組成、化学的機能化、寸法に強く依存する。一方、グラフェンは、組織工学の基板としても利用できる。この場合、さまざまなグラフェン材料の特性の中で最も重要なのは導電性であろう。導電性を利用することで、神経ネットワークに指示を与えたり、神経の成長や分化を促したりすることができ、再生医療の分野で大きな可能性を秘めている。この総説では、この分野の成果と新たな課題を包括的に紹介するとともに、近い将来、最もエキサイティングな方向性を示したいと考えている。例えば、血液脳関門を通過して神経細胞に到達できる多機能ナノ粒子（NP）の開発や、特定の薬剤をオンデマンドで送達することなどが挙げられます。また、生体内での神経細胞の成長と再生を促進するための3次元足場の設計にグラフェン材料を使用した場合の最新情報や、ハイブリッド複合材料／多層有機エレクトロニクスデバイスの構成要素としてグラフェンを使用した場合の可能性についても述べる。最後に、グラフェンと生体材料の界面を正確に理論的にモデル化する必要性についても触れている。グラフェンとタンパク質や細胞膜との相互作用をナノスケールでモデル化し、さまざまなグラフェン材料が神経細胞の興奮性や生理機能に影響を与える電荷移動の物理的メカニズムを説明している。

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はじめに

グラフェン（G）は、Sp2結合した炭素原子が2次元（2D）の蜂の巣状の格子に密に配置された単層または数層のシートであり、その厚さはわずか0.34 nmである（Geim, 2009）。それぞれの炭素原子は、3つのμ結合と、隣接する原子と結合できる面外のπ結合を持っている（Geim, 2009）。Gは、これまでに発見された化合物の中で、厚さ1原子の最も薄い化合物であり、最も強い化合物である。さらに、軽くて柔軟性と透明性があり、電気的にも熱的にも高導電性であることから、スーパーキャパシタ（Hessら、2011年、Sahooら、2015年、Casaluciら、2016年）、フレキシブルエレクトロニクス（Edaら、2008年、Mericら、2008年）、プリンタブルインク（Zhuら、2015年、Bonaccorsoら、2016年）など、幅広い分野での利用の可能性が広がっている。2015; Bonaccorso et al., 2016）、電池（Hassoun et al., 2014; Dufficy et al., 2015）、光学および電気化学センサー（Pumera, 2009; Du et al., 2010; Kang et al, 2010）、エネルギー貯蔵（El-Kady and Kaner, 2013; Bonaccorso et al., 2015; Ambrosi and Pumera, 2016）および医療（Novoselov et al., 2012; Casaluci et al., 2016; Kostarelos et al., 2017; Reina et al., 2017）。G関連材料（GRM）には、単層および数層のG（1〜10層；GR）、G酸化物（単層、1: GO）、還元型G酸化物（rGO）、グラファイトナノおよびマイクロプレートレット（10層以上であるが、厚さが100nm未満、平均横方向のサイズがそれぞれnmおよびμmのオーダー）、GおよびG酸化物量子ドット（それぞれGQDsおよびGOQDs）、およびハイブリッド化されたさまざまなGナノコンポジット（Bianco, 2013; Wick et al. , 2014; Cheng et al., 2016）。) このように異なる組成と構造を持つこれらの化合物は、全く異なる生物学的反応を引き起こすため、生物医学的応用を計画する際に考慮しなければならない非常に多様な特性を有している。そのため，GRMを使用した生物学的実験の再現性の欠如を克服するためには，使用するGRMを適切に特定し，特性を明らかにすることが重要です。

ここ数年、生体電極、バイオイメージング、ドラッグ／遺伝子／ペプチドデリバリー、ナノポアベースのDNAシーケンシング、幹細胞の分化、組織工学へのGおよびGRMの利用など、Gのバイオメディカル応用への関心がますます高まっています（Feng et al.2013; Yang et al.2013）。さらに、GRMは、ナノキャリアおよびナノイメージングツール、2次元および3次元の組織スカフォールド、抗菌コーティングおよびバイオセンサーの設計に大きな関心を寄せている（Bitounisら、2013; Dingら、2015）。GRMを医療に利用することへの関心は、主に、機械的特性、柔軟性、透明性、熱電気伝導性、優れた生体適合性など、Gの並外れた特性にある。GRMは、現在、埋め込みデバイスに使用されている金属やシリコンの限界を克服することができますが、これらのデバイスは、剛性が高く、炎症を起こす可能性が高く、生理学的環境での長期安定性が低いという特徴があります。さらに、生物医学分野では、病的な状態に対してより特異的で安全かつ効果的な治療法を求める声が高まっており、革新的な治療法が強く求められています。これらの前提を踏まえて、Gに関する大量の研究は医療用途に焦点を当てており、特に神経学の分野では、その機械的および電子的特徴により、現行のデバイスを置き換えるための有力な候補となっている（Kostarelosら、2017年、Reinaら、2017年）。

GRMをベースにした医療機器のもう一つの魅力は、Gの生体適合性が証明されつつあることにあり、これは市場に投入されるあらゆる新しいバイオマテリアルにとって考慮すべき極めて重要な問題である。Gの表面は、その化学的性質により、細胞レベルで強力かつ非破壊的な相互作用が可能であり、特定の化学的機能化によって改善することも可能である（Cheng et al. これは、組織の修復や再生を志向するGベースの支持体や足場に特に当てはまり、実際に神経や骨の組織工学ではすでに有望な結果が示されている（Chengら、2016年、Reinaら、2017年）。主に薬物/遺伝子の送達や画像診断を目的としたGナノシート分散液に関しては、シナリオはかえって複雑です（Braminiら、2016年、Mendonçaら、2016a、Rautiら、2016年）。この材料の安全性は、実際にはまだ困難な問題であり、合成方法、純度を含む最終製品の品質、最終的な微量汚染物質の存在、およびGが適用される生物学的環境を考慮して、すべてのケースを個別に分析する必要があります。

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グラフェンの神経科学への応用

グラフェンの生物医学的応用は、継続的に拡大している分野です。中枢神経系（CNS）の障害に対する従来の治療法には多くの課題があり、そのため、イメージング、ドラッグデリバリー、神経細胞の再生、電気的な記録やセンシングのための最新技術を上回る新しいツールを開発することは、現代の医学と神経科学の主な目標の1つです（Baldrighi et al.、2016）。炭素関連材料の開発以来、ナノテクノロジーは以下のような数多くのアプリケーションに強い影響を与えてきました（図1）。血液脳関門（BBB）を通過して障害のある脳領域に到達するための薬物、遺伝子、タンパク質の送達、2次元（2D）または3次元（3D）のスカフォールドと神経細胞とのインターフェイスにより、損傷時に細胞間のコミュニケーションを回復させる神経再生技術。細胞のラベリングによる疾患バイオマーカーのin vivoセンシングや生物活性分子のリアルタイムモニタリングなど、特異性と信頼性の高い診断ツールや、高感度電極による記録やGベースのプラットフォームによる電気的局所刺激による神経細胞活動のモニタリングやモジュレーションなど（Mattei and Rehman, 2014; John et al. , 2015; Chen et al., 2017; Kostarelos et al., 2017; Reina et al., 2017）。)

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具体的には、研究者たちはすでに、細胞のラベリングやリアルタイムのライブセルモニタリングのためのCNSでのGの使用（Wangら、2014年、Zuccaroら、2015年）、通常はBBBで拒絶される分子の脳への送達（Tonelliら、。2015；Dongら、2016）；細胞培養のためのGベースのスカフォールド（Li N.ら、2013；Menaaら、2015；Defteraliら、2016b）；およびG電極に基づく細胞分析（Medina-Sánchezら、2012；Liら、2015）。さらに、Gを神経細胞とインターフェイスさせることは、神経細胞の電気的挙動を探ったり、神経細胞のプロセスの制御された伸長を促進することで神経細胞の再生を促進したりするために極めて有利であることも提案されました（Liら、2011年、Tuら、2014年、Fabbroら、2016年）。これらの応用は、神経腫瘍学、神経画像処理、神経再生、機能的神経外科、末梢神経外科など、神経治療学の新しい研究ラインを開くものです（Mattei and Rehman, 2014）。

本レビューでは、将来の神経科学への応用のために特に興味深いと思われるGRM研究のいくつかの側面に焦点を当てます。すなわち、（i）薬物および遺伝子送達のためのナノキャリアとしてのG、（ii）BBBとのGの相互作用、および（iii）神経再生、刺激および記録のためのGベースの2Dおよび3D複合体です。最後の(iv)章では、生物学者や医学者がGの分子や細胞と生体との相互作用をよりよく理解するために役立つ、計算機モデリングアプローチの概要を紹介しています。

いかにして脳に到達するか。Gベースのナノキャリアと血液脳関門

グラフェンナノシートと神経細胞との相互作用

Gナノシートの細胞毒性の共通メカニズムは、さまざまな細胞種に関する文献で報告されており、細胞膜との物理的相互作用（Seabraら、2014年）、細胞の細胞骨格の破壊（Tianら、2017年）、活性酸素種（ROS）の生成による酸化ストレス（Chen M. et al, 2016；Mittalら、2016）；ミトコンドリア損傷（Pelinら、2017）；染色体断片化、DNA鎖切断、点変異、酸化的DNA変質などのDNA損傷（Akhavanら、2012；Fahmiら、2017）；オートファジー（Chenら、2014）；およびアポトーシスおよび／またはネクローシス（Limら、2016）。さらに、発表されたデータによると、GOはG、rGOおよび水素化Gよりも毒性が低く、小さなナノシートは大きなフレークよりも毒性が低く、高分散性のG溶液は凝集性のものよりも安全であることが示唆されている（Donaldsonら、2006年、Akhavanら、2012年、Bianco、2013年、Kurapatiら、2016年、Ouら、2016年）。

CNSの場合、GRMと神経細胞およびアストロサイトとの相互作用のメカニズムは、まだ十分に調査されておらず、不明瞭であり、主にGRMの内在的特性に依存する未定義のシナリオを描いている。神経細胞のような細胞株を用いた研究はほとんど行われておらず、高用量でのGの毒性作用が示されている。特に、PC12細胞では、Gとカーボンナノチューブの両方が、濃度および形状に依存して毒性反応を引き起こした（Zhang et al. Gの暴露により、活性酸素が発生し、10μg/mlの濃度でアポトーシスの証拠が見られました。この研究と同様に、GOナノシートは低濃度では明らかな細胞毒性を示さなかったが、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞株では用量および時間に依存した細胞死が観察された（Lv et al.、2012）。初代培養に関するものでは、in vivoおよびin vitroともに、G曝露による神経細胞およびグリア細胞の生存率の変化は検出されなかった（Braminiら、2016；Mendonçaら、2016b；Rautiら、2016）。しかし、GOナノシートに暴露された初代神経細胞培養は、カルシウムおよび脂質のホメオスタシス、シナプスの連結性および可塑性など、多くの生理学的経路に明らかな変化を示した（Braminiら、2016年、Rautiら、2016年）。Gナノシートは、細胞内に取り込まれると、リソソームに優先的に蓄積するほか、ミトコンドリア、小胞体、場合によっては核を物理的に損傷することが確認された（John et al.2015）。別の研究では、ナノシートの不規則な突起や鋭いエッジが細胞膜を損傷し、リン脂質層を突き破ってGを細胞内に侵入させる可能性が示唆されています（Li Y. et al. これらの特徴は、細胞質内の遊離したGRMが、カーボンナノチューブによる細胞毒性と同様に、細胞骨格の破壊、細胞運動の障害、細胞周期の遮断を引き起こす可能性があることから、さらなる安全性の懸念を生じさせる。

上述の影響は、Gの慢性的な曝露によって観察された。このことは、神経組織に対するGの生体適合性を長期的に評価し、in vivoでの影響をin vitroでの細胞および分子の相互作用と関連付けることが早急に必要であることを強調している。GによるCNS毒性の最初の強力な証拠は、最近のin vivo研究から得られた（Ren et al.、2016）。Gによる環境汚染の状況を再現するために、研究者たちは、Danio rerio（ゼブラフィッシュ）の幼魚がいる環境でGOを水中に分散させた。曝露された幼魚は、中枢神経系にGOを発現し、最も重要な点として、運動機能の障害、ドーパミン神経細胞の減少、レビー小体の形成など、パーキンソン病に類似した症状が誘発された。これらの効果は、より一般的な代謝障害に加えて、ミトコンドリアの損傷とカスパーゼ8経路を介したアポトーシスの結果であると考えられる。GおよびGOナノシートは、事前に表面を機能化せずに静脈内注射すると、ネズミの中枢神経系に少量蓄積する（Mendonçaら、2016a,b）。また、rGOは、BBBの破壊を伴う静脈内注射後に、脳組織、特に視床と海馬で検出された（Mendonçaら、2016b）。興味深いことに、rGOフレークを投与したラットは、震え、痙攣、唾液、涙、呼吸困難、運動異常などの神経毒性の臨床症状を示さなかった。これらの結果は、Zhangら（2015）が、rGOナノシートを経口投与したマウスの運動活性と神経筋の協調性が短期間で低下したと報告した研究結果とは対照的である。この相違は、Gの生体適合性を決定する上で、投与経路が重要なパラメータであることを強調している。このように、Gの生体への侵入経路は、その用量、大きさ、機能化、および凝集とともに、最終的な生物学的効果を決定する。

上述の影響は、慢性的なGの曝露で観察され、長期的な研究で神経組織に対する材料の生体適合性を早急にさらに評価する必要性を強調しており、できればin vivoの影響をin vitroの細胞および分子の相互作用に結び付けたいと考えている。GによるCNS毒性の最初の強力な証拠は、最近のin vivo研究から得られた（Ren et al.、2016）。Gによる環境汚染の状況を再現するために、研究者たちは、Danio rerio（ゼブラフィッシュ）の幼魚がいる環境でGOを水中に分散させた。曝露された幼魚は、中枢神経系にGOを発現し、最も重要な点として、運動機能の障害、ドーパミン神経細胞の減少、レビー小体の形成など、パーキンソン病に類似した症状が誘発された。これらの効果は、より一般的な代謝障害に加えて、ミトコンドリアの損傷とカスパーゼ8経路を介したアポトーシスの結果であると考えられる。GおよびGOナノシートは、事前に表面を機能化せずに静脈内注射すると、ネズミの中枢神経系に少量蓄積する（Mendonçaら、2016a,b）。また、rGOは、BBBの破壊を伴う静脈内注射後に、脳組織、特に視床と海馬で検出された（Mendonçaら、2016b）。興味深いことに、rGOフレークを投与したラットは、震え、痙攣、唾液、涙、呼吸困難、運動異常などの神経毒性の臨床症状を示さなかった。これらの結果は、Zhangら（2015）が、rGOナノシートを経口投与したマウスの運動活性と神経筋の協調性が短期間で低下したと報告した研究結果とは対照的である。この相違は、Gの生体適合性を決定する上で、投与経路が重要なパラメータであることを強調している。このように、Gの生体への侵入経路は、その用量、大きさ、機能化、および凝集とともに、最終的な生物学的効果を決定する。

まとめると、Gナノシートの生体適合性に関する現在のデータは、まだ議論の余地がある。これは、市場に存在する材料の不均一性が高いことと、合成方法が多種多様であることが原因である。黒鉛源（出発材料）、合成方法、化学物質の使用、および最終製品の分散形態（溶液または粉末）によって、Gは異なるサイズ、厚さ、化学的表面、および凝集状態を示す可能性があり、これらすべてが生体系との相互作用に様々な影響を及ぼすことになる。しかし、Gナノシートが環境や健康に悪影響を及ぼす可能性があることは明らかであり、バイオメディカルプラットフォームとしての利用については議論の余地があります（Braminiら、2016年、Reinaら、2017年）。現在までのところ、GOナノシートは、生体流体への溶解性と安定性が高いことから、バイオメディカル研究においては、原始的なGよりも好まれている（Chowdhuryら、2013年、Servantら、2014a、Reinaら、2017年）。

中枢神経系への生体分子デリバリーのためのグラフェン

上述したように、Gナノシート分散液をバイオメディカル用途に使用すると、材料の固有の特性のために、いくつかの望ましくない効果を与える可能性がある。興味深いことに、Gの表面を官能化することで、これらの欠点のほとんどを軽減することができる。Gナノシートの物理的・化学的特性を調整することで、より高度な生体適合性を得ることができる。さらに、カーゴは、π-πスタッキング相互作用、水素結合、または疎水性相互作用を介してロードすることができる（Georgakilas et al.、2016）。これにより、通常はBBBで拒絶される生体分子を送達するためのプラットフォームとしてGを使用する魅力的な可能性が生まれた。実際、Gは大きな表面積を持ち、その表面にさまざまな分子を結合させることができるため、薬剤、遺伝子（siRNAやmiRNAを含む）、抗体、タンパク質を保持・運搬するのに適した材料となっている（Chen et al. さらに、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ハロゲン化アルキル基、アジド基などの官能基を加えることで、その化学構造を改変することも可能である（John et al.、2015）。純粋なGは疎水性が高く、塩やタンパク質を含む生体液などの水溶液中で凝集する傾向があるため、表面機能化は、多量の生体分子を担持して標的細胞に特異的に送達できるという二重の利点があり、同時に材料のより均質な分散を可能にする（Mattei and Rehman, 2014; John et al. さらに、機能化されたGナノシートは、全身、標的、および局所的な送達システムに適用することができる（Fengら、2011年、Kimら、2011年、Liu J.ら、2013年）。このように、このアプローチは、多機能で汎用性の高い医療プラットフォームの需要の高まりを満たすことができる。

また、そのユニークな蛍光性、光安定性、および磁気共鳴プロファイルのため、いくつかの研究では、脳腫瘍のin vivo可視化を強化し、分子抗がん戦略の腫瘍ターゲティングを改善するために、Gベースのナノ粒子（NP）を組み込む可能性が検討されています（Kimら、2011年、Yangら、2012年、Zhangら、2013年、Hsiehら、2016年）。また、この場合、in vivoの研究では、GRよりもGOがこれらの応用に良い可能性を持っていることが明らかになりました。実際、全身に投与された放射性標識GO（188Re-GO）は、少量（0.04％；Zhang X.ら、2011年）ではありますが、脳実質に到達することができました。

血液-脳関門の通過

BBBは、生体内で最も重要な生理的バリアの一つであり、脳と循環系を隔てるダイナミックなインターフェースを形成している(Pardridge, 2001; Begley, 2004)。バリアは脳血管内皮細胞によって形成され、その周囲を基底膜とアストロサイトの血管周囲エンドフィートが取り囲み、バリアシステムを神経細胞につなげている(Abbott et al., 2010)。内皮細胞は、周皮細胞やミクログリア細胞とともに、バリア機能を支え、その細胞間シグナルを調節して、脳への流入や輸送を制御している（Dohgu et al.、2005年、Abbott et al.、2010年）。BBBは、くも膜や脈絡叢上皮とともに、血流と神経組織の間の様々な化学物質や異物の通過を制限する一方で、酸素からインスリンやアポリポプロテインEなどの各種タンパク質まで、代謝機能に不可欠な物質や栄養素の通過を可能にしている(Abbott et al., 2006; Strazielle and Ghersi-Egea, 2013)。興味深い点は、脳の毛細血管内皮細胞は、他の部位の内皮細胞とは明らかに異なり、隣接する細胞間に多くのアドヘンス結合やタイトジャンクションが存在し、細胞間のフェネトレーションが存在しないことである（Abbottら、2006、2010）。脳毛細血管内皮細胞間のタイトジャンクションは、BBBの最も重要な構造的・解剖学的要素の一つである。これらは主要なバリアーを形成し、細胞膜を緊密に結びつけ、水、分子、イオン、その他の生体分子の細胞間移動を調節している（Begley and Brightman, 2003; Abbott et al. これらの特徴を踏まえて、BBBの透過性は、脳毛細血管内皮細胞間の細胞間結合の緊密さを反映していると強調する研究者もいる（Rubin et al. 言い換えれば、BBBの特徴である低い透過性は、ほとんどの部分が副細胞の通過を制限するタイトジャンクションとアドヘレンズジャンクションによって引き起こされている（Wolburg and Lippoldt, 2002）。その結果、ほとんどの分子輸送は、ほとんどの内皮のように接合部を通ってパラセルラー的に移動するのではなく、BBBを越えてトランスセルラー的に移動することを余儀なくされている（Abbott and Romero, 1996; Wolburg and Lippoldt, 2002; Hawkins et al.

現在までに、BBBを横切る輸送のメカニズムがいくつか特定されている（図2）。その中には、パラセルラーまたはトランスセルラー経路、輸送タンパク質（キャリア）、受容体を介したトランスサイトーシス、および吸着性トランスサイトーシスが含まれる（Abbott et al.2006）。トランスサイトーシスとは、生体分子が細胞膜の侵入口に取り込まれ、さらに偏光した細胞単層の一方の側から他方の側に輸送されるプロセスである。インスリンやトランスフェリンなどの特定のタンパク質は、受容体を介したエンドサイトーシスとトランスサイトーシスによって取り込まれ、受容体を介した輸送として知られているプロセスである（Kreuterら、2002年、Ripら、2009年、Ulbrichら、2009年、2011年）。アルブミンなどの天然の血漿タンパク質は輸送性が悪いが、カチオン化することで、吸着媒介性エンドサイトーシスやトランスサイトーシスによる取り込みが増加する（Abbott and Romero, 1996; Pardridge, 2007a）。トランスサイトーシスに加えて、非常に小さな水溶性化合物は、パラセルラー水性経路を介してタイトジャンクションを透過することができる。パラセルラー輸送では、タイトジャンクションが「ゲートキーパー」として働き、水溶性物質のパラセルラー拡散を調節する。例えば、ショ糖は水溶性の分子であり、パラセルラー拡散によってBBBを限られた量で通過することができる（Ek et al. また、内皮の大きな脂質膜表面積は、酸素などの小さな気体分子や、バルビツール酸塩やエタノールなどの薬物を含む脂溶性物質の効果的な拡散ルート（経細胞輸送）となる。さらに、内皮にはグルコース、アミノ酸、プリン塩基、ヌクレオシド、コリンなどの輸送タンパク質が存在する。P糖タンパク質のように、エネルギーに依存して排出トランスポーターとして働くものもある（activative-efflux transport）。

以上のような複雑な輸送システムのネットワークにより、BBBは重要な神経保護機能を果たしているが、一方で、BBBはCNS疾患の治療薬の通過を妨げるという難点もある。製薬会社は、BBBを通過できる薬剤の設計に多大な労力と費用を投じてきたが、成功例は非常に少ない。神経系疾患のために開発された薬剤のうち、実際にCNSに到達するのは全体の5％に過ぎないと報告されている（Pardridge, 2007b）。

ナノ粒子工学

NPの治療効果は、主に外部環境から内部のバイオコンパートメントに届けられたときのNPの浸透率に依存する。したがって、生物学的バリアは、NPの曝露による生物学的影響を決定する上で中心的な役割を果たしている。ナノマテリアルは、治療や診断に大きな可能性を秘めているが、同時に脳への意図しないアクセスの可能性もある（Herda et al.2014）。生体内での研究では、様々な方法での投与により、NPがCNSに見出されることが示された（Semmler-Behnkeら、2008年、Zensiら、2009年、2010年）。並行して、NPのトランスロケーションの調査のために、ヒトおよびマウスのBBBのin vitroモデルが使用され、開発されてきた（Andrieux and Couvreur, 2009; Ragnaill et al., 2011; Bramini et al.

数多くのナノデリバリーシステムが提案され、in vitroおよびin vivoの両方で治療目的でテストされてきた（Pandey et al.、2015）。最先端のシステムの中でも、ポリマーNPは薬剤のカプセル化能力が高いため、BBB構造を損傷することなく疎水性の薬剤を保護し、輸送することができるので有望である（Tosi et al. アポリポタンパクEをNPに結合させることは、NPが既存の経路を利用して脳にアクセスするメカニズムとして提案されており(Kreuter et al., 2002; Wagner et al., 2012)、実際に薬物の取り込みが促進されている(Michaelis et al., 2006)。このアプローチは、生体適合性の高いリポソームでは特に有望である(Re et al., 2011)。一般に、特異的なペプチドをNPの表面に結合させることで受容体を介したトランスサイトーシスを利用する方法は、BBB横断の分野で最も研究されているシステムである。トランスフェリン、インスリン、レクチン、リポタンパク質などの様々な分子は、生理的にこのルートを利用して血流から脳へと通過する。したがって、これらのリガンドは、治療目的でBBBを通過する薬剤装填NPの通過率を高めることができる（Herdaら、2014年、Pandeyら、2015年、Åberg、2016年）。最近では、BBBでトランスサイトーシスを受けることが知られている外因性ペプチドも、CNSでの入り口を高めるためにNP表面にグラフト化された。ここでは特に、ジフテリア毒素受容体（DTR）とHuman Immunodeficiency Virus（HIV）-TATタンパク質に注目した。毒性や免疫原性を持たないDTRの変異体は、in vitroおよびin vivoの両方で、ナノリポソームやポリブチルシアノアクリレートNPをBBBを越えて輸送する試験が行われ、実際、グラフト化されたNPのみがバリアを通過することができた（van Rooy et al.2011; Kuo and Chung, 2012; Kuo and Liu, 2014）。同様の戦略は、ポリエチレングリコール（PEG）分子を介して高分子ミセルまたはSiO2 NPの表面に結合させたHIV-TATタンパク質の誘導体を用いた場合にも成功しました（Liuら、2008a,b; Zhao X.ら、2016）。さらに、BBBの生理的なトランスサイトーシスメカニズムを利用するために、脳血管内皮の受容体を特異的に標的とする抗体グラフトNPが合成されている（Loureiro et al. 今回も、最も有望な結果が得られたのは、抗インスリン（Ulbrichら、2011年）、抗トランスフェリン（ClarkとDavis、2015年）、抗LDL（Kreuter、2014年）の各受容体の抗体でした。抗体工学におけるこれらの最近の開発は、標的特異性を高め、材料の周辺部での損失を回避することによって、脳の治療法に関する知識を向上させたにもかかわらず、これらの知見を研究から臨床応用に移すためには、依然として大きな努力が必要である。

球状NPの大きな課題は、薬物をカプセル化し、受容体を介したエンドサイトーシスによってBBBを通過し、最終的に特定の細胞亜集団を標的とすることができる多因子工学的システムを得ることが困難であることである。実際、NPは高い表面積を持っているにもかかわらず、体内のさまざまなコンパートメントに向けてシステムを駆動・誘導するために、表面にペプチドや分子を設計する余地はまだ限られている。このシナリオでは、BBBの透過性を外部から調節することと、NPのエンジニアリングを組み合わせた新しいアプローチが最近開発され、現在研究中である。

界面活性剤による被覆とハイパーサーミア

上述したリガンドによるNP表面修飾と非常によく似たアプローチとして、界面活性剤でNPを覆う方法がある（Pardridge, 2012）。この戦略は、タイトジャンクションの一過性の破壊を誘導し、内皮の高い透過性につながるため、大きな分子やナノキャリアがBBBを容易に通過して脳に到達することを可能にする（Pardridge, 2012; Saraiva et al., 2016）。さらに、ポリ（ソルベート80）は、アポリポタンパクEおよび／またはA-Iを吸着することができ、さらにNPに、脳内皮に発現するリポタンパク受容体と結合してBBBを横断する能力を与える（Kreuterら、2003；Petriら、2007）。

ここ数年、研究者たちは、BBBの損傷を軽減し、CNSに輸送される薬剤の量を増やすことを目的とした革新的な戦略を採用してきた。研究の1つの流れは、NPの通過を容易にするために、BBBの透過性の時間的および領域的なアップレギュレーションを得ることを目的としていた。これは例えば、A2Aアデノシン受容体を活性化して、脳毛細血管内皮間の細胞間スペースを増やすことで達成された（Gao et al. 同様の効果は、内皮の局所的な温度を41～43℃に上昇させるハイパーサーミアを誘導することで、BBBと物理的に相互作用させることで得られる。この温度変化は、タイトジャンクションを選択的に破壊することで作用し、BBBの傍細胞透過性を増加させる。集束超音波（FUS）とマイクロバブルを用いて興味深い結果が得られており、組織毒性は非常に低く、ドキソルビシン（DOX）のCNSへの蓄積が高いことが示されている（Treat et al.2007）。その他、ハイパーサーミアを起こす技術として、マイクロ波や高周波がある。後者は、従来の化学療法や放射線療法と組み合わせてグリオーマ治療のために生体内で試験され、有望な結果が得られています（Wang et al.、2012年）。さらに最近では、レーザーパルスと磁気加熱という、より高度なハイパーサーミア誘導法が試されている。近赤外（NIR）の超短パルスレーザーは，特定の領域でBBBを破壊し，脳内の大分子の通過を可能にする（Choi et al. 代わりに磁気NP（MNP）が、低周波磁場を用いた磁気加熱から発生する熱を介して生物活性化合物を送達するために使用された（Tabatabaei et al.、2015）。MNPの位置もライブでモニターできるため、この技術は病気の治療と診断の両方に応用できる。

このように有望な結果が得られているにもかかわらず、BBBの透過性を一時的かつ局所的に調節・干渉する技術には、血流中に存在する不要な分子や微生物の通過を非常にうまくコントロールできないという大きな問題がある。タイトジャンクションが開くと、脳に到達する薬物の量が増えるのは事実であるが、BBBによって安全に血管に拘束されている有害化合物も同時に通過してしまい、患者に高いリスクをもたらすことも事実である。

グラフェンとBBB。脳へのドラッグ＆ジーンデリバリーの新しい方法

ドラッグデリバリーシステムの重要な目標は、特定のターゲットを認識し、制御された方法で薬物を放出するスマートなツールを作ることである(Allen and Cullis, 2004)。脳科学分野におけるGベースのアプリケーションの主な制限は、静脈内注射時の脳実質への蓄積量が非常に少ないことである。静脈内に注入されると、Gはイオン、脂質、タンパク質と結合して材料が凝集し、生体分子コロナが形成され、Gの分布に影響を与えたり、炎症反応を引き起こしたりする可能性がある（Dell’Orcoら、2010年）。さらに、ナノシートはマクロファージによって貪食され、炎症性サイトカインの活性化と放出を誘発し（Zhou et al.、2012年）、いくつかの血液成分と相互作用して溶血を誘発する（Liao et al. 最後になりますが、Gナノシートは、標的となる組織ではなく、網膜内皮系に蓄積する可能性があります(McCallion et al., 2016)。

特に困難なのはBBBの通過であり、BBBは薬剤の送達を著しく制限し、大分子の神経治療薬のおよそ100％、すべての低分子薬剤の98％以上をブロックする（Upadhyay, 2014）。Mendonçaら（2016b）によると、全身に注入されたrGOナノシートは、BBBパラセルラータイトネスの一過性の低下を介してBBBを横断し、ラットの視床と海馬に蓄積するという。逆に、ナノ材料の生体適合性を向上させるために通常使用されるPEGによるrGOの機能化は、インビボでBBBの破壊とアストロサイトの機能不全を誘導する（Mendonça et al.、2016a）。GをBBBを通過させるための様々なアプローチの中で、超音波をマウスに当ててBBBタイトジャンクションを物理的に開き、ドラッグデリバリーシステムを脳内に侵入させた。この方法によれば、Gd-DTPAとポリ（アミドアミン）デンドリマーをグラフトしたGOナノシートに、EPIと腫瘍抑制効果のあるmiRNA Let-7を担持させ、尾静脈注射で脳に到達させることができた（Yang et al. この方法の主な利点は、BBBの開通が可逆的であることである。興味深いことに、Gは同時に高コントラストMRI分析を可能にし、脳組織内の送達システムの分布を定量化した（Yang et al.、2014）。これらの結果は有望であるが，特に長期的な治療を行う場合には，詳細な薬物動態学および毒性学の研究が必要である。また，これまでに研究されたものと比較して，この技術はCNSにおけるGの蓄積量がはるかに多いことを念頭に置いている。

また、Gの表面を特定の生体分子で機能化し、BBBを通過できるようにすることもできる（Allen and Cullis, 2004; Goenka et al., 2014; John et al. 最近の研究では、高い負荷容量とpH依存性の挙動を持つ革新的なナノデリバリーシステムが調査された。GO@Fe3O4ナノコンポジットに、BBBの血管内皮細胞やグリオーマ細胞の表面に過剰発現している受容体に結合する鉄輸送血清糖タンパク質であるラクトフェリン（Lf）を結合させて、Lf@GO@Fe3O4を得た。NPに神経膠腫の治療薬であるDOXを担持させた後（図3）、NPを静脈内に注射したところ、粒子が血流から神経膠腫細胞に移動する様子が確認された（Liu G. et al. NPは他の臓器に比べて中枢神経系に集中しており、DOXのみを注射した動物の対照と比較して、腫瘍の退縮に高い効率が見られた。同様のアプローチをとり、同様の有望な結果を得たYang L.ら（2015年）は、PEG-GOナノシートをHIVのTatタンパク質で機能化し、これにより、バリア内皮を完全に残したまま、薬剤を搭載したPEG-GOシステムがトランスサイトーシスによってBBBを通過することができました。

先に述べたように、BBBに挑戦するもう一つの有望な戦略は、界面活性剤によるNPコーティングである（Kreuterら、2003年、Gelperinaら、2010年）。Kanakiaら（2014）は、ナノシートをデキストランで機能化することで、GOのCNSへの送達を改善した。この材料は、BBBを通過し、毒性作用を及ぼすことなく脳に到達することがわかった。驚くべきことに、CNSにおけるGOの濃度は時間とともに上昇したが、他の臓器ではほとんど変化がなかった。このように、本研究では、CNSにおけるGのゆっくりとした蓄積と材料の長期的な持続性が示唆されており、ドラッグデリバリーシステムの観点からは心強いが、Gナノシートの長期的な毒性に関する安全性の懸念も生じており（Baldrighi et al.

Gナノシートとの連結に成功した薬剤の数は増加している。Liu Z.ら（2008）は、GO-PEGフレークが非共有結合のファンデルワールス相互作用を介して、水不溶性の芳香族分子7-エチル-10-ヒドロキシ-カンプトテシン（SN38）で装飾できることを示した。同様に、異なるカンプトテシンアナログ（Liu Z. et al., 2008）、イレッサ（ゲフィチニブ；Liu Z. et al., 2008）、DOX（Sun et al., 2008）などの他の薬剤も、単純な非共有結合によってGO-PEG複合体上に付着させることに成功した。 rGO-PEG粒子は、in vitroおよびin vivoの両方の研究において、タイトジャンクションを破壊することなくBBBの内皮層を横断することができた（Mendonça et al., 2016a,b）。最近では、Xiaoら（2016）が神経保護ペプチドに結合させたGQDを使用した。アルツハイマー病のマウスモデルに静脈内注射すると、学習と記憶、樹状突起の形成を増加させ、炎症性サイトカインレベルを低下させることができた。

Gベースのドラッグデリバリーシステムの主な用途の1つは、G複合体と化学療法剤を結びつけることによる抗がん治療である。近赤外領域に強い光吸収を持つGベースのハイブリッド材料は、がんの光線療法への有望な応用のために集中的に研究されている(Liu et al., 2011; Robinson et al., 2011; Yang et al., 2012; Hönigsmann, 2013)。このアプローチの理論的根拠は、近赤外レーザーの刺激によって腫瘍領域に蓄積されたGが生み出す熱を利用して、がん細胞を死滅させることにある。この手法は、U251グリオーマ細胞を用いたin vitroで成功を収めている（Markovic et al.2011）。このような実験的アプローチは、BBBによる制限を克服するのに役立つ可能性があり、特に膠芽腫のような非常に抵抗性で攻撃的な腫瘍の治療に非常に有望であるため、特に注目されている。

可視光（VIS）および近赤外光（NIR）領域におけるGの固有の特性は、in vitroおよびin vivoの両方でのバイオイメージング（Zhang et al.2013）のための魅力的なツールでもある（Gollavelli and Ling, 2012）。例えば、アプタマー・カルボキシフルオレセイン・GO複合体は、マウスに人工的に移植された腫瘍など、生きた細胞の特定のクラスターの細胞内モニタリングやin situ分子プローブに用いられた。また、GOナノシートは、光エネルギー吸収後の熱膨張に伴う音響応答を利用した光音響イメージングにも用いられている(Wang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qian et al., 2012)。特に中枢神経系への応用については、in vivo研究により、頭蓋内に投与したPEG-GOおよびその誘導体が、2光子顕微鏡によって脳内をイメージングできることが示された（Qian et al. このイメージング技術を通じて、PEG-GO複合体の蛍光信号の組織への浸透性が高いことから、脳実質内の3D分布マップを再構築することができる。これらの有望な結果は、特に、腫瘍化した細胞を特異的に標的とする生体分子を用いて材料を設計した場合、Gを脳のがん病巣をイメージングする診断ツールとして使用することにつながる可能性がある。さらに、ターゲティングが達成されれば、特定の用途に応じてGの特性を最適化することができる。例えば、サイズや酸化状態を変更して、発光波長をVISから組織への浸透性が高いNIRにシフトさせ、画像診断装置の深度を向上させることができるかもしれない。Gの光学特性を他の生分解性材料や機能性材料と組み合わせることで、様々なライブイメージング用途に適したGベースの複合材料やハイブリッド材料を作ることが可能になるだろう。これまでのところ、ほとんどのツールは、がん細胞株を用いたin vitro、およびがんの検出と診断のためのin vivoでテストされており、CNSの探索と画像化にそれらを使用する可能性は未解決のままである（Zhangら、2013；Chengら、2016）。

ドラッグデリバリーと同様に、遺伝子工学でもGの特性を利用して、バイオメディシンの新たな可能性を開くことができます。この場合のコンセプトは、核酸、すなわちDNAや、miRNAやshRNAを含むさまざまな種類のRNA分子を、特定の標的細胞集団に送達し、生理的状態を回復させることである（Cheng et al. 非ウイルスシステムの開発は、将来の医療アプローチにとって非常に重要であり、Gは、長い核酸を収容することの難しさ、バッチ間の変動、コストの上昇、ウイルスベクターシステムの免疫原性など、ウイルスシステムの本質的な制限のいくつかを克服することができる可能性がある（Kimら、2011年、Johnら、2015年）。正電荷を帯びたポリマー（PEI、BPEI）、デンドリマー（PAMAM）、多糖類によるデコレーションなど、さまざまな戦略が開発されており、細胞膜との相互作用を促進することで遺伝子導入効率を高めている（Liuら、2014年、Paulら、2014年）。機能化の手法が同じであることから、Gベースのハイブリッド材料を用いて薬剤と遺伝子の両方を同時に送達することができる（Zhang L. et al. これにより、薬剤とトランスフェクションの効率が大幅に向上するため、相乗効果が期待できる。また、Gナノシートは、カチオン性ポリマーであるPEIで機能化されている。PEIは、RNAとDNAの両方の負電荷を帯びたリン酸基と強い静電的相互作用を形成する非ウイルス性遺伝子ベクターである（Feng et al. さらにChenら（2011）は，PEIで機能化したGOを遺伝子導入に用いることで，細胞毒性を伴わずに高いトランスフェクション効率を実現したと述べている。

以上のように、Gベースのデリバリーシステムは、適切に機能化されていたり、補完的な技術と組み合わされていたりすれば、診断（すなわちイメージング）と治療（すなわちドラッグおよび遺伝子デリバリー）の両方の神経科学的アプリケーションの有望な候補となります。さらに、裸のGやrGOを神経系に曝すことによる毒性効果を示す研究がいくつかあるが（Braminiら、2016年、Mendonçaら、2016b、Rautiら、2016年）、現在までのところ、機能化Gが神経細胞やBBBに有害であるという確かな証拠はない。バイオメディカル応用のためのGベースの技術は常に急速に進化しているので、近い将来、新しい安全で高度な神経適合性を有する材料が開発されるかもしれない。

グラフェン基板を神経細胞のインターフェイスに

組織工学は、破壊された組織を適切な生体材料と接触させることで、その機能を回復させることを目的としている。これは急速に拡大している研究分野であり、長期的な応用を目的とした、生体適合性が高く、機能的で低侵襲なインプラントを実現するための革新的なアプローチが求められている。神経系に関しては、アクティブでダイナミックな埋込みデバイスは、神経細胞の電気的活動の刺激と記録を同時に行うことができるため、非常に有利である。ニューラル・インターフェースとして使用するために、様々なタイプの埋め込み型デバイスが開発されています。中でも、パーキンソン病のジストニアや振戦の治療に臨床的に使用されている、CNSの深部構造を電気的に刺激する脳深部刺激インプラント（DBI）（Permutter and Mink, 2006）、網膜変性がある場合に生き残っているニューロンを電気的に刺激したり、外部の音を電気インパルスに変換する網膜インプラントや蝸牛インプラント（Spelman, 2006; Picaud and Sahel, 2014）、脊髄損傷後の運動リハビリのための中枢および末梢神経系刺激装置（Hatsopoulos and Donoghue, 2009）、診断目的で脳の電気活動をマッピングする頭蓋内電極（Chang, 2015）などがあります。

Gは、複合ナノ構造の光学的、電気的、機械的特性を向上させることができるため、Gの固有の特性を利用して、神経細胞インターフェース用のGベースのデバイスを設計することができます。一般的に、優れた神経インプラントの基本的な要件は、炎症反応を最小限に抑えた良好な生体適合性、神経記録を想定した場合の適切なS/N比、およびインプラント組織の完全性を維持した最小限の侵襲性である。典型的には、Gベースのスカフォールドは、その次元性、すなわち、一次元（繊維、リボンまたは糸）、二次元（紙、フィルム）および三次元に応じて分類することができる（Chengら、2016；Reinaら、2017）。ナノメディシンにおけるGベースの構造体の最も一般的な用途には、in vivoでの神経細胞の再生、刺激および記録のための足場のエンジニアリング、およびオンデマンドの薬物送達が含まれる（Congら、2014年、Chengら、2016年）。生体内での応用に関するものでは、2Dデバイスの使用はほとんどが平面電極に限られている（Liuら、2016；Parkら、2018）。実際、いくつかのGベースの2Dデバイスが設計されているが、技術的な制限のため、これまでは主にin vitroでテストされてきた（神経細胞に適用された2D Gベース基板の包括的なレビューについては、（Bramini et al.2018）を参照）。最近、Defteraliら（2016a）によって有望なin vitroの結果が得られた。コーティングされていない熱還元グラフェン（TRG）基板を用いて、神経幹細胞（NSCs）を成長・分化させ、事前に生体分子をコーティングすることなく、G材料上で直接成長させた。TRG基板上で培養された細胞は、カーボンナノチューブ基板上で培養された細胞と比較して、細胞数が多く、シナプス結合の数も多く、効率的な多系統分化が見られたことから、機能的なニューロンネットワークの研究にGを利用できる可能性が示唆された。一方，CVD-Gの場合，単層Gを最終的な基板に移すことが重要なステップとなるが，このプロセスではGの構造にコンタミや欠陥が生じることが多い。また、Gの化学的・物理的特性にできるだけ影響を与えない適切な基板はまだ見つかっていない。さらに、2Dデバイスは、同じ表面化学的特性を持つ3Dスカフォールドと比較して、in vitroでの神経幹細胞の活性が低く（Jiangら、2016）、形態、寸法、アクセス性、多孔性が重要なスカフォールドの特徴であることを明確に示している。実際、脳の再生を促すためには発泡体やハイドロゲルが、末梢神経の再成長を促すためには方向性のある導管が、それぞれの足場として選ばれています。次の段落では、デバイスのG含有量や構造とその機能性との関連性に焦点を当てながら、神経科学における3D Gベースのスカフォールドの使用に関する最新の開発について説明します。

3D G-Based Scaffold: コンポジット、フォーム、ファイバー、ハイドロゲル

G系材料の神経分野への応用は、損傷部位全体の神経再生をサポートできる3次元スカフォールドの開発があって初めて可能となる。平面的な2D G-scaffoldのユニークな特性は、3D G-構造によって、よりin vivoの状況に近い条件で細胞が成長できる微小環境を提供することができます。さらに、前述のように、3次元構造は巨大な界面領域を有し、電荷輸送のための高伝導性経路を提供するため、神経ネットワーク形成や神経再生の支援に有用である。

いくつかの3Dスカフォールドが作成され、in vitroでテストされているが、これまでのところ、生体内に移植されたものは非常に限られている（図4）。例えば、成体ラットの線条体または脳室下帯に移植されたGコートしたエレクトロスパンPCLマイクロファイバー製のスカフォールドがある。Gコーティングされた移植物は、裸のスカフォールドと比較して、ミクログリア/マクロファージの浸潤が少なく、一方でSVZからのアストロサイトおよび神経芽細胞の移動をサポートした（Zhouら、2016）。自立した3D GO多孔質スカフォールドを損傷したラットの脊髄に移植したところ、局所的または全身的な毒性はなく、慢性的に移植した場合にも良好な生体適合性を示した（López-Dolado et al. 注目すべきは、長期（30日）の移植では、血管新生と部分的な軸索再生を促進することができたことである（López-Doladoら、2016年）。G系材料を用いて末梢神経系の再生を促進する試みはこれまでに行われていない。この方向への第一歩は、G-シルクフィブロイン複合ナノファイバー膜のエンジニアリングに代表される。この複合材料は、Gの導電性および機械的強度と、絹の良好な相溶性を兼ね備えていることから注目されている。生体内での試験は行われていないが、Gシルク膜はin vitroでシュワン細胞の成長をサポートしている（Zhao et al.

さまざまな3次元GおよびGOフォームが、幹細胞に適合する基材であることが示された（Crowderら、2013年、Li N.ら、2013年、Serranoら、2014年、Guoら、2016年、Sayyarら、2016年）。Li N.ら（2013）は、NSCsの成長および増殖に適した足場として、3D Gベースのフォーム（3D-GF）を最初に記載した。3D-GF上で成長したNSCsは、神経細胞やアストロサイトに分化することができた。さらに、3D-GFは、NSCsの分化を促進するためにNSCsを電気的に刺激するための最適なプラットフォームであることも注目された。同様の結果は、最近ではrGOマイクロファイバーでも得られており、これはNSCの生存率をサポートし、神経細胞の表現型に向かわせることができた（Guoら、2017年）。興味深いことに、Gスカフォールドの特徴（すなわち、硬い対軟らかい）は、細胞の接着と増殖に異なる影響を与え、NSCの分化をそれぞれアストロサイト系とニューロン系に向かわせることができた（Ma et al. 3D-GF上で培養した海馬ニューロンは、2D-GF基板と比較して、より広範な接続性と高いネットワーク同期性を特徴としており、脳の生理学的特性をよりよく模倣している（Ulloa Severino et al.、2016）。ミクログリア細胞も3D Gフォーム上で培養した。この場合、足場の3D構造が培養細胞の神経炎症反応に影響を与えたが、これはおそらく、3Dの地形的特徴による空間的制約のためである（Song et al. 2D材料について説明したのと同様に、3D G/GOスカフォールドも細胞刺激電極として使用され、NSCsの神経細胞の成長と分化を促した（Li N. et al.、2013; Akhavan et al.、2016）。

新世代の電気応答性3D-Gスカフォールドも開発されている。すなわち、軟組織を模倣したGベースのハイドロゲルであり、刺激をトリガーとした制御された薬物放出の応用が提案されている。ハイブリッドGベースのハイドロゲルは、主にGO、G酸化物過酸化物（GOP）またはrGOを用いて合成され、ごく少量の材料をハイドロゲルマトリックスに組み込むことで、電気的、機械的、熱的特性を向上させている（Servant et al.、2014b）。このような材料は、神経細胞の成長とシナプス活動の発達をサポートすることができる（Martínら、2017年）。同様のアプローチに従い、コルチコステロイド薬であるデキサメタゾンをポリ（乳酸-co-グリコール）酸NPに担持させ、続いてアルギン酸ヒドロゲルに加えた。最終的な複合体は、移植後の局所的な薬物投与のために、金およびイリジウム電極のコーティングとして使用された(Kim et al., 2004; Kim and Martin, 2006)。最終的には、制御された電気刺激によって生物学的に活性な分子を放出し、同時に表面の柔らかさを向上させ、インプラントの生体適合性を高めることができるデバイスを開発することが目標である。

全体として、神経科学用途の3DインプラントにG素材を使用することはまだ限られている。しかし、生物医学の他の分野から学べることは多い。例えば、G-ヒドロゲルや発泡体は、最近、抗がん剤治療（Xuら、2017年、Zhangら、2017年）や、骨（Luら、2016年）、軟骨（Nietoら、2015年）、筋肉（Mahmoudifardら、2016年）の再生を誘導するために提案されている。私たちは、これらの異なる分野間のクロス・ファーティライゼーションが、近い将来、神経系アプリケーションのための機能的な3D、Gベースのインプラントの開発につながることを期待しています。

グラフェンを用いた神経記録・刺激用デバイス

神経機能障害や運動障害の回復のための臨床的介入は、柔軟な支持体に適応し、最も一般的な金属電極ベースの技術を凌駕する可能性のある埋め込み型刺激デバイスの研究を惹きつけ、挑戦している。ポリマー製のインターフェースは、機械的な適合性という点では優れていますが、生理的な条件下での耐久性や、何よりも適切な電気伝導性に欠けることがよくあります。生きた神経組織または細胞に接触したGベースの電極を用いてこれまでに行われた神経刺激のほとんどは、その成長および／または分化を調節するために限定されている（Thompsonら、2015）。

脳深部または皮質刺激、人工内耳および網膜インプラントなどの神経刺激技術は、通常、最小の注入電荷を提供することによって組織の機能応答を引き出すインプラントデバイスの能力に依存しており、したがって、電極を必要とする（Kostarelosら、2017）。現在までのところ、in vivoの研究では、G電極が神経細胞の活動を刺激して記録できることが示されている。G電極は、PtやAuなどの一般的な貴金属電極に対して、わずかに高い値の電荷注入を行う。新しい有望な材料や化合物は、Gを利用して、パリレンCに埋め込まれたレーザー還元されたGOの生体内プローブの場合のように、数十mC cm-2の電荷注入レベルにまで達します（Apollo et al. 著者らは、この新しいフレキシブルな自立型電極を用いて、網膜神経節細胞を生体外で刺激するだけでなく、猫の視覚野から生体内で神経活動を記録している。これは、Gベースのデバイスで神経を刺激した数少ない報告例の一つです。その他の興味深い応用例としては、CVD-Gでカプセル化した銅マイクロワイヤーをMRI互換の神経デバイスに利用したり（Zhao Y. et al., 2016）、フレキシブルなGマイクロトランジスタを脳活動のマッピングに利用したり（Blaschke et al., 2016）していますが、やはり生体内での神経活動の記録に限られています。さらに、Kuzumら（2014）も、生体内での電気生理とイメージングの同時記録のために、柔軟で低ノイズのG電極を開発しました。ビククリンを注入しててんかん状の活動を誘発した後、同じサイズのG電極とAu電極を用いてラットの大脳皮質半球から同時に記録することができた。その結果，G電極はAu電極に比べてS/N比が6倍も低く，Gを用いた新しい記録システムを採用することで，脳の電気的活動を研究する上で明確な利点が得られることがわかった（図5）。さらに，G電極の透明性のおかげで，in vivoの2光子イメージングと皮質の電気生理学的記録を組み合わせて，皮質領域をイメージングすることも可能であった（Kuzum et al.

さらなる進歩は、外部ノイズを低減して信号増幅を可能にするG電界効果トランジスタ（G-FET）の開発によって達成された（Velievら、2017年）。フレキシブルなGベースのスーパーキャパシタは、PEDOT:PSSやrGO、G-ポリアニリンナノコンポジットやCVD GOフォームなどのポリマー材料とハイブリッド化すると、二重層キャパシタンスが改善されるため、最近では神経刺激の可能性を示している（Yang W. et al. バイオ・メディカル分野でGを活用するもう一つの方法は、損なわれた視力の回復に寄与する光感受性神経インターフェースのオプトエレクトロニクス特性を高めることである。MoS2とインクジェットGをベースにした光検出器のポリイミドアレイは、最近、フレキシブルな網膜プロテーゼとして提案され、生体適合性がin vitroでテストされた（Hossain et al.、2017）。それにもかかわらず、これらの努力のほとんどは、神経科学のアプリケーションのための使用可能な電極にまだ変換する必要があります。

グラフェンと相互作用する生体分子システムの計算モデルとシミュレーション

生体分子と無機表面との相互作用の基礎となる微細な構造の詳細を理解することは、ナノメディシンにおける多くのアプリケーションにとって極めて重要である。最近、これらの相互作用のダイナミクスに関する実験結果が報告されているが、多くのトポロジー的な詳細は、特にns～μsのタイムスケールでの初期事象においては不明である。このギャップを埋めるために、計算機モデリングと分子動力学（MD）シミュレーションの使用は、実験技術ではアクセスできない詳細を提供し、関連する貢献をする（Ozboyaci et al.

その有望な特性により、Gは様々な用途で大きな可能性を示しており、Gに捧げられた計算研究の数は絶え間なく増加している（Cavallucci et al.、2016）。古典的なMDシミュレーション（すなわち、原子間相互作用の古典物理学的記述に基づく）は、近年、G系材料と生体分子との相互作用に関する大量の結果を生み出した。特に、これらの研究では、生体分子を付着させるための基板またはナノポアとしてのGの特性を深く理解することができ、Gの挙動をGOの挙動と区別することができた。さらに，MDシミュレーションは，膜やタンパク質複合体などのさまざまな生体構造との相互作用を調べることで，Gの生体適合性を検証するために広く用いられている。これらの研究では、Gは、細菌に対する有望なベクターとして、また生体複合体を擾乱することができる材料として記述されている。

これらのシステムの古典的なシミュレーションにおける最も重要な問題は、Gに対する適切な力場パラメータのセットを定義することであり、これにより、生物学的システムのシミュレーションに使用される主流のソフトウェアパッケージ、例えばGROMACS（Abrahamら、2015年）、CHARMM（Brooksら、2009年）またはNAMD（Phillipsら、2005年）を用いたシミュレーションを成功させることができる。さまざまな選択が検討されていますが、G原子を電荷を持たないレナードジョーンズ球として記述することが一般的に受け入れられています（Hummerら、2001年、Patraら、2009年、2011年）。異なる力場で使用されるGパラメータのリストが最近報告されました（Pykal et al. この段落の目的は、マルチスケールレベルで広く研究されているG系材料と生体分子との相互作用に関する計算機研究の主な成果をまとめることです。全原子モデルや粗視化モデル、相互作用研究のためのさまざまなパラメータ（いわゆる力場）など、さまざまな異なるアプローチが用いられている。

計算生物物理学における一般的な問題は、シミュレーションで調べることのできるサイズや時間スケールと、生物学的に関連するメカニズムのそれらとの間のギャップである。分子モデリングは、生体システムを全原子レベルで詳細に記述することができますが、そのため、せいぜい150 nm程度の大きさで、マイクロ秒単位の時間スケールでの研究に限られてしまいます。このギャップを埋める可能性があるのは、粗視化分子動力学（CGMD）シミュレーションである。粗視化分子動力学シミュレーションは、自由度の数を制御的に減らし、短距離相互作用関数を使用することに基づいている。このような単純化により、CGシミュレーションの解像度は低いが、必要な計算資源は少なくて済み、より大きな系をより長い時間スケールで研究することができる。古典的な全原子シミュレーションとCGMDシミュレーションを交互に行うことで、マルチスケールの記述を採用するのが有望なアプローチである。

最近では、G-バイオ分子システムに関するいくつかの計算科学的研究が発表されており、それらは以下のテーマ分野に分類されています。

バイオメディカル応用のための機能的構造の研究という観点から、G基質へのタンパク質やペプチド（特に酵素や血液タンパク質に関心がある）の吸着。その結果、GOは、異なる分子の結合のための反応部位として働くことができる酸素含有基のおかげで、水溶液や他の有機溶媒に良好な溶解性を有することがわかった。一例として、固体基板上への酵素の固定化は、その活性を向上させるための効率的なプロセスであり、また、医療用インプラントなどの血液と接触するナノ材料の生体適合性を決定する主な要因は、その表面へのタンパク質の吸着である。

2.Gの生体膜との相互作用を利用して、Gの生物学的安全性や毒性を評価するとともに、新クラスの抗生物質のベクターとしての機能を期待する。

3.温度やpHなどの様々な要因に対して生物学的な孔よりも感度が低いナノセンサーとして期待されているGナノポアによるDNAやタンパク質の検出。

次の段落では、上記のポイント1と2の研究のいくつかをより詳細に説明し、ポイント3の研究については、興味のある読者に、DNA検出の研究については以下の著作（Satheら、2011、2014、Wellsら、2012、Qiuら、2015、Barati Farimaniら、2017a）を参照し、タンパク質検出の研究についてはBarati Farimaniら（2017b）を参照してください。

グラフェンへの生体分子の吸着

原始的なグラフェン基板

グラフェンへのタンパク質の吸着を調べるために、全原子のMDシミュレーションを行った最初の例として、Zuoら（2011）は、ヴィリンのヘッドピース（HP35）を用いた研究を紹介している。このシミュレーションでは、HP35が基板上に急速に吸着し、タンパク質の二次構造と三次構造の両方に関連するコンフォメーション変化が生じることが示された。その結果、芳香族残基とGとの間のπ/πスタッキング相互作用が、タンパク質-G相互作用を支配していることがわかった。これは、HP35と湾曲したカーボンナノ構造とのシミュレーションで観察されたものとは異なる。

その後、生体分子を吸着する基質としてのGの特性が調べられている。Katochら（2012）は、MDシミュレーションを、原子間力顕微鏡、ラマン分光法、赤外分光法などの実験手法と組み合わせて行い、Gやグラファイトへのペプチドの結合を解明した。本研究では、12量体のペプチドが吸着時に複雑な網目構造を形成し、α-helixとは異なるらせん状のコンフォメーションをとることを明らかにした。Chengら（2013）は、異なるペプチドとGとの相互作用をMDシミュレーションで調べた。このシミュレーションでは、平らなG基板がペプチドの吸着後に歪んでしまう。著者らは、ペプチドのサイズ、数、分布、配列などの複数の要因が、G基質との相互作用に影響を与えると結論づけている。Zhouと共同研究者（Gu et al., 2015）は、MDシミュレーションを行って、ウシのフィブリノーゲン（BFG）などの血液タンパク質がG表面に急速に吸着する様子を示した。このシミュレーションでは、前述の強いπ/πスタッキング相互作用の効果に加えて、塩基性残基によるもう1つの重要な相互作用が記述されているのが特徴的です。塩基性残基は、その側鎖と基質の間に強い分散相互作用があるため、このプロセスにおいて重要な役割を果たしている。全体的には、疎水性、静電性、およびπ/πスタッキング相互作用が、Gへの分子の固定化を推進する。

Kimら（2015）は、ペプチドによるGの認識を、Gの化学組成、オーバーインポーズ層の数、および下層の基板支持体に関して調べた。この計算結果は、共鳴ラマン分光法、水晶振動子マイクロバランス、水の接触角測定に基づく実験データとともに、Gの品質がGとペプチドの相互作用の重要な要因であることを示しており、一方で、相互作用はGの層数や下層の支持基材には大きな依存性を示さないようである。Chengら（2013）は、絹フィブロインの異なるペプチドとGとの間でMDシミュレーションを行った（Cheng et al.、2015）。この研究は、Gがタンパク質の分子内相互作用と競合してβシートの含有量を減らす一方で、秩序のない二次構造と弱い分子内相互作用を持つセグメントの安定性を高めることを示している。全体的に見ると、Gはこれらの代表的な配列の分子コンフォメーションに顕著な効果をもたらす。

さらに，HughesとWalsh（2015）は，エンハンストサンプリングMD法を用いて，配列とGへの吸着ペプチドの結合との関連性を調べた。まず，Well-Tempered Metadynamics（Barducci et al.，2008）を用いて，天然に存在する20種類のアミノ酸すべての吸着自由エネルギーを求め，ペプチド-グラフェンの吸着研究を解釈するためのベンチマークとした。これらの計算では、側鎖が平坦または密集しているアミノ酸に強い結合が見られた。その結果、P1A3は溶液中でも吸着中でもほとんど無秩序なコンフォメーションを示すのに対し、P1のらせん状のコンフォメーションは、強く結合する残基の相互作用を介してGに吸着することで安定化することがわかった。

2016年、Yeoらは、二乗平均平方根変位、水素結合数、らせん構造の含有量、相互作用エネルギー、ペプチドの質量中心変位などの広範なパラメータの分析を通じて、単一および複数のウシ血清アルブミン（BSA）ペプチドセグメントのGへの吸着メカニズムを調査した。その結果、シングルセグメントシステムでは、ペプチドと基質の間の強い相互作用により、らせん構造が不安定になることがわかった。一方、マルチセグメントシステムでは、ヘリカルの総量がよりよく保存されることが観察されており、これはペプチドの保護的な集合作用を意味している。さらに最近では、Noら（2017）が、ペプチド-ペプチドおよびペプチド-Gの相互作用の最適化を介して、G上での自然に触発された2次元ペプチドの自己組織化を報告した。原子論的シミュレーションにより、G上でのペプチドの自己組織化をもたらす最適なペプチド配列を決定したところ、最適なペプチド配列はペプチド-G相互作用エネルギーを最小化し、さらにペプチド-ペプチド相互作用エネルギーも最小化することで、G上で安定した複合体が得られることが示唆された。

GO基質

GO基板

Chongら（2015）では、酸素原子の存在によるGOのさまざまな利点を検証するために、GOおよびrGO層への生体分子の付着を調査しました。血清タンパク質とGOナノシートとの相互作用を、大規模な実験技術とMDシミュレーションを用いて調査し、GOとrGOの高い吸着能力を示した。ただし、実験ではGOとrGOを使用したが、GOナノシートに存在する表面の関連する非酸化領域をシミュレートするために、プリスティンGを選択したことを指摘しておきたい。GOの作用は、標準的な酸化プロセスの挙動を記述するLerf-Klinowskiモデル（Lerfら、1998年）を用いて基板を表現することで、より明確に調査されました。このアプローチを用いて、2つのパラダイム論文（Sun et al., 2014; Zeng et al., 2016）は、GOが付着したタンパク質の強化された吸着性を示すことを実証した。まず、Sunら（2014）では、α-chymotrypsin（ChT）の活性に対するGOの阻害作用を原子論的に記述しています。この結果は、GOが酵素阻害のための有望な受容体として考えられるという仮説を支持するものである。次に、Zengら（2016）は、強化法アンブレラサンプリング（Kästner, 2011）を用いた平均力のポテンシャル（PMF）計算を用いて、ウイルスタンパク質R（Vpr）の断片であるVpr13-33に対するGOの結合エネルギーの詳細を示しています。

最近では、Willemsら（2017）が、G表面に安定化したリン脂質膜パッチのダイナミクスを調査しました。これらのシステムは、センサーデバイスの機能化における可能性を示している。著者らは、実験的手段とCGMDシミュレーションを統合して、GおよびGO担体上の担持脂質膜（SLM）の分子特性を特徴づけた。その結果、表面の性質によって、安定化した脂質構造のトポロジーが大きく異なることがわかり、GおよびG酸化物の表面が脂質膜に及ぼす分子的な影響について新たな知見が得られた。

全体として、このように膨大な量のデータが得られているにもかかわらず、十分な実験結果が得られていないため、この新しい計算機アプリケーションの分野では、多くの基本的な問題が未解決のままである。特に、基板上の含酸素基の詳細な分布を決定することは困難であり、吸着メカニズムの記述に大きな損失をもたらしている。

グラフェンの生体膜との相互作用

グラフェンの生物学的安全性や潜在的な毒性を理解するには、生体分子複合体との相互作用が重要である。代表的な研究（Tu et al., 2013）では、GRおよびGOナノシートが大腸菌の内膜および外膜の分解を誘導することが示された。具体的には、MDシミュレーションにより、Gが脂質二重層からリン脂質分子を積極的に抽出し、その表面に固定することが示された。これらの結果は、Gが細菌を殺すことができる便利なツールであることを紹介しているが、Gがいくつかの生体分子に対しても破壊能力を示すという豊富な文献が存在する（Luan et al.、2015）。

このような状況において、CGMDシミュレーションの結果は、まったく異なるシナリオを示しています。CGMDを使ってGと生体分子の相互作用を研究した最初の例として、Titovら（2010）が挙げられます。そこでは、マルティーニ力場（Marrink et al., 2007）を用いて、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC膜）で形成されたリン脂質二重層とGナノシートの相互作用を研究しています。その結果、Gシートは膜の疎水性内部にホストされ、安定したG-脂質構造を形成することがわかった（図6）。

その後、Guo et al. (2013)、Li Y. et al. (2013)、Mao et al. (2014)などの他の作品では、様々なCGMDアルゴリズムを用いてこれらのシステムを調査しています。しかし、これらの研究ではすべて、Tuら（2013）の結果とは対照的に、脂質の抽出や膜の損傷は観察されていません。さらに最近では、Gが細胞膜の損傷を引き起こすかどうかを解明するために、計算機シミュレーションが用いられた（Chen J. et al.、2016）。全原子MDシミュレーションを用いて、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）二重層に対するGとGOの両方の相互作用を調べたところ、Gは脂質の尾部に平行な位置をとることで素早く膜内に入り込むことが明らかになった。逆に、GOは観察された時間スケールの間、自発的には膜に入らなかったが、二重層にドッキングすると、膜に孔を形成した。

特に重要な生体膜システムは、BBBなどの生体バリアーの形成に関わるものである。計算機研究は、G系材料へのバリア暴露の効果を調べるのに有用であるが（図6）、このような複雑な構造を研究することは、構造情報の不足によってまだ妨げられている（Alberiniら、2017年）。

結論としては今後の課題と展望

ここ数年、GRMは生物医学的応用を含む幅広い技術分野で研究・利用されている。非侵襲的な薬理学的アプローチによる神経疾患の治療は、いまだに大きな課題となっています。脳の構造と重要な機能を維持しながらBBBを迂回して、薬物や生体分子、さらには遺伝子を脳に効率的にカーゴデリバリーする戦略を開発することは、科学者にとって極めて重要である。ナノメディシンの目的の一つは、患者にとって非常に侵襲的な手術やその他のアプローチを避けて、細胞を標的とし、薬物を制御して放出する革新的な方法を生み出すことです。このシナリオでは、適切なリガンドと受容体の複合体を選択することが、ナノキャリアを構築する際の重要な設計要素であり、材料、サイズ、最終的な機能化の選択も同様である。受容体を介したトランスサイトーシスはBBBを通過するための基本的な経路であるが、2D材料のような次世代のナノキャリアの開発や、経鼻投与などの代替送達経路の調査と最適化は、科学界にとって最も重要な課題である。

BBBの課題」以外にも、神経科学の分野では、グラフェン研究の最新の成果が役立つ可能性がある。神経腫瘍学では、腫瘍をターゲットとしたイメージング、光熱療法、抗がん剤の投与や遺伝子治療のためのGナノシートやGNPの開発が有益である。新しい電気、化学、光学センサーは、神経集中治療や神経モニタリングに大きな影響を与える可能性があります。さらに、さまざまな形態や状態のGを組み合わせ、多様な化学的機能化を行い、他の生体材料と結合させてGベースの複合体を形成することで、診断と治療の両方に使えるオールインワンのツールを考案することができ、強力な治療装置を効果的に構築することができるかもしれません。

最後に、組織工学の研究では、Gをベースにした新しい脳-インプラントインターフェースを開発し、材料の電気伝導性を利用して、細胞間のコミュニケーションや修復を促進することが期待されています。MDは、G/細胞およびG/タンパク質の相互作用を極めて正確に示し、予測することで、より強力なGベースのデバイスを設計するための指針となるからです。

しかしながら、初期の研究では、Gの生体適合性、特に2Dや3Dの足場に他の材料と結合させた場合の生体適合性が示されていたにもかかわらず、生体内で成功したシステムはわずかしかなかった。今後、神経科学分野に限らず、技術的な応用が期待されるまでには、特にG素材を長期間使用した場合の生物学的効果について、さらなる調査が必要である。